Uma equipe de cientistas determinada a investigar os acontecimentos anteriores no complexo da Umbrella Corporation – a Colméia – acaba acidentalmente liberando o T-Virus, que havia matado todos os pesquisadores do local. A contaminação acaba se espalhando por toda Raccoon City, agora devastada. Para impedir uma catástrofe de proporções ainda maiores, a Umbrella isola completamente a cidade, deixando todos os habitantes presos.

Alice (MILLA JOVOVICH) acorda em um laboratório, onde foi submetida a diversas experiências que a deixaram com estranhas habilidades, como agilidade e força sobre-humana. Matt (ERIC MABIUS), o outro sobrevivente, foi cobaia de um teste ainda maior por estar em uma constante mutação, tornando-se a mais nova arma biológica da Umbrella, conhecido como Nemesis.

Para tentar minimizar a invasão, é mandado para Raccoon City o soldado Carlos Olivera (ODED FEHR) juntamente com um pequeno esquadrão. Devido ao grande número de zumbis, sua missão fica praticamente impossível, tornando-o mais uma presa fácil no local. Mais tarde, juntam-se a ele na tentativa de sobreviver a oficial Jill Valentine (SIENNA GUILLORY) e um companheiro policial, a repórter Terry Morales (SANDRINE HOLT) e o motorista L.J. (MIKE EPPS). O grupo acaba encurralado em uma igreja, onde são atacados por Lickers, rapidamente derrotados pela agora poderosa Alice. Porém, esse não é o único obstáculo no caminho para fora da cidade…

Ao acompanharmos essa longa tentativa de fuga, conhecemos também o Dr. Charles Ashford (JARED HARRIS), um dos cientistas mais importantes da Umbrella Corp. e criador do T-Virus. Sua filha, Angela Ashford (SOPHIE VASSEVOUR), acabou permanecendo na cidade devido a um acidente com sua escolta para fora do local. Agora, ele está disposto a qualquer coisa para ter sua filha de volta, nem que isso signifique desafiar seus superiores na corporação.

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